ABSTRACT
Objetivo: Optimizar la prueba de microneutralización (MNT) para detección de anticuerpos neutralizantes contra el virus dengue serotipo 2 (DENV-2) en la línea celular Vero-76. Materiales y métodos: Se evaluaron diferentes concentraciones celulares (0.6 x105 cel/mL, 0.9 x105 cel/mL, 1.2 x105 cel/mL), porcentajes de 2 %, 3 % y 4 % de suero bovino fetal (SBF), número de pasajes del stock de virus y los días de incubación. La semilla viral se confirmó por RT-qPCR. El DENV-2 se propagó realizando 5 pasajes en células Vero-76, seguidamente se tituló el virus en placas de 96 pozos y se evaluaron 2 métodos de infección celular: monocapa y células en suspensión, además se determinó el día óptimo de coloración de las células. Obtenidos los resultados, se procesaron mediante MNT para DENV-2 las siguientes muestras: 5 sueros negativos a DENV-2 y YFV (Virus de la Fiebre Amarilla), 5 sueros negativos de anticuerpos a DENV-2 y positivos de anticuerpos a YFV y 5 sueros positivos de anticuerpos a DENV-2 seleccionados mediante la prueba de neutralización por reducción de placas (PRNT). Resultados: El método óptimo para MNT utilizó células en suspensión (0.9 x 105 cel/mL), 2 % de SBF y semilla viral pasaje 5. La mínima dilución capaz de diferenciar una muestra positiva a DENV-2 fue 1:40 y el tiempo de incubación para la MNT para DENV-2 fue de 10 días. Conclusión: La MNT con el método de células en suspensión y medio de cultivo con 2 % de SBF permite detectar anticuerpos neutralizantes IgG contra DENV-2 con resultados confiables, pudiendo analizar un mayor número de muestras con ahorro de materiales.
Objective: To optimize the microneutralization test (MNT) for the detection of neutralizing antibodies against serotype 2 of dengue fever virus (DENV-2) in a Vero-76 cell line. Materials and methods: Different cell concentrations were assessed (0.6 X 105 cells/mL, 0.9 X 105 cells/mL, and 1.2 x 105 cells/mL) with 2%, 3%, and 4% fetal bovine serum, virus stock passage number, and incubation days. Viral particles were confirmed using RT-qPCR. DENV-2 disseminated with 5 passages in Vero-76 cells, then, the virus was titrated in 96-well plaques, and two methods for cell infection were evaluated: single layer, and suspended cells. Also, the optimum day for cell staining was determined. Once results were obtained, the following samples were processed using MNT for DENV-2: five sera negative for DENV-2 and yellow fever virus (YFV), five sera negative for antibodies against DENV-2 and positive for antibodies against YFV, and five sera positive for antibodies against DENV-2 that were selected using the plate reduction neutralization test. Results: The optimum method for MNT used suspended cells (0.9 X 105 cells/mL), 2% fetal bovine serum, and viral particles at the 5th passage. The minimal dilution able to differentiate a positive sample for DENV2 was 1:40, and the MNT incubation time for DENV-2 was ten days. Conclusion: MNT with the cell suspension method and a culture medium with 2% fetal bovine serum allows the detection of IgG neutralizing antibodies against DENV-2 with reliable results, so that larger sample sizes may be assessed, saving materials to be used.
ABSTRACT
RESUMEN Objetivo: extraer y evaluar la actividad antiviral de los compuestos de Chondracanthus chamissoi y Chlorella peruviana contra DENV-2 en células Vero-76. Materiales y métodos: se extrajeron el carragenano de Chondracanthus chamissoi, los carbohidratos solubles de Chondracanthus chamissoi y Chlorella peruviana y se realizó la prueba de toxicidad en células VERO-76 y la evaluación de la actividad antiviral. Resultados: se obtuvieron carragenanos de la fase de esporofito y gametofito de Chondracanthus chamissoi, los mismos que fueron identificados, mediante infrarrojo, como k-carragenano. Por cromatografía se identificaron nueve azúcares (ribosa, xilosa, arabinosa, fructuosa, manosa, galactosa, sucrosa, maltosa y lactosa) en la muestra de carbohidratos solubles de Chondracanthus chamissoi fase gametofito y cuatro azucares (glucosa, sucrosa, maltosa y lactosa) en la de Chlorella peruviana. Los compuestos de Chondracanthus chamissoi y la solución de carbohidratos solubles de Chlorella peruviana no presentaron efecto citotóxico; los carbohidratos del extracto crudo de Chlorella peruviana sí los tuvieron. Todas las fracciones del extracto crudo de Chondracanthus chamissoi fase gametofítica fueron positivas por la prueba de reducción del número de placas(50) a la dilución 1:5. El k-carragenano de Chondracanthus chamissoi en ambas fases y los extractos crudos de carbohidratos solubles de Chondracanthus chamissoi, Chlorella peruviana y la solución de carbohidratos solubles de Chlorella peruviana inhibieron el crecimiento del virus dengue, pero no los carbohidratos del extracto crudo de la Chlorella peruviana. Conclusiones: los compuestos obtenidos de Chondracanthus chamissoi y Chlorella peruviana presentan actividad antiviral contra DENV-2 por lo cual es necesario continuar los estudios del potencial antiviral de estos compuestos fraccionados y purificados.
ABSTRACT Objective: to extract and determine the antiviral activity of compounds from Chondracanthus chamissoi and Chlorella peruviana against DENV-2 in Vero-76 cells. Materials and methods: carrageenan from Chondracanthus chamissoi and soluble carbohydrates from Chlorella peruviana were extracted, and toxicity tests in VERO-76 cells and antiviral activity were determined. Results: carrageenan from Chondracanthus chamissoi sporophyte and gametophyte phases were obtained, the compound was identified as k-carrageenan using infrared light. Nine sugars (ribose, xylose, arabinose, fructose, mannose, galactose, sucrose, maltose, and lactose) were identified using chromatography in the soluble carbohydrate mix from Chondracanthus chamissoi, and four sugars (glucose, sucrose, maltose, and lactose) from Chlorella peruviana were identified. Compounds from Chondracanthus chamissoi and Chlorella peruviana soluble carbohydrate solutions did not show any cytotoxic effect, carbohydrates from the raw extract from Chlorella peruviana did have this effect. All fractions from the raw extract from the gametophyte phase from Chondracanthus chamissoi were positive in the plate reduction test at 1:5 dilution. K-carrageenan from Chondracanthus chamissoi in both phases, as well as the crude extracts of soluble carbohydrates from Chondracanthus chamissoi and Chlorella peruviana as well as the soluble carbohydrate solution from Chlorella peruviana inhibited growth of dengue virus, but that was not the case with the carbohydrates of the raw extract from Chlorella peruviana. Conclusions: compounds obtained from Chondracanthus chamissoi and Chlorella peruviana show antiviral activity against DENV-2, so it is necessary to continue studies aiming to determine the antiviral potential of these fractioned and purified compounds.
ABSTRACT
RESUMEN Objetivos . Comparar diferentes métodos de extracción de ADN a partir de quistes y trofozoítos de Giardia spp. mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional. Materiales y métodos. Se aislaron quistes de Giardia spp. a partir de 65 muestras coprológicas procedentes de hospitales de referencia nacional, obteniéndose una carga promedio de 5x104 parásitos. Asimismo, se cultivaron trofozoítos de Giardia intestinalis (ATCC® 30957™) obteniéndose una carga parasitaria de 5x106. Se compararon once métodos de extracción para quistes y seis para trofozoítos. La concentración y pureza del ADN extraído se determinó por espectrofotometría y el rendimiento de la extracción se evaluó mediante la amplificación de los genes beta giardina (bg) y glutamato deshidrogenasa (gdh) por PCR semi-anidada. Resultados. Se observó que el método I mostró la mayor concentración de ADN a partir de quistes (12,24 ng/µL), pureza (1,4) y mejor rendimiento (100% amplificación bg, 60% gdh) en comparación con los otros métodos evaluados. En el caso de los trofozoítos el método que no tuvo pretratamientos presentó la mayor concentración de ADN, pureza y rendimiento (26,56 ng/µL; 1,85; 100% amplificación bg y gdh). Conclusiones. Los pretratamientos mecánicos, de choque térmico y enzimáticos son necesarios para la ruptura de la pared quística de Giardia spp., siendo el marcador molecular bg de mayor rendimiento para detección de ADN de quistes. Los trofozoítos no requieren pretratamientos para lograr resultados satisfactorios. Se cuenta con una metodología reproducible para la extracción de ADN de Giardia spp. a partir de cualquier estadio evolutivo.
ABSTRACT Objectives. To compare different methods of DNA extraction from cysts and trophozoites of Giardia spp. using the conventional polymerase chain reaction (PCR) technique. Materials and Methods. Cysts of Giardia spp. were isolated from 65 coprological samples from national reference hospitals, obtaining an average load of 5x104 parasites. In addition, Giardia intestinalis trophozoites (ATCC® 30957™) were cultured obtaining a 5x106 parasitic load. Eleven extraction methods for cysts and six for trophozoites were compared. The concentration and purity of the extracted DNA were determined by spectrophotometry and the extraction yield was assessed by amplification of the ß-giardin (bg) and glutamate dehydrogenase (gdh) genes with a semi nested PCR assay. Results. It was observed that method 1 showed the highest concentration of DNA from cysts (12.24 ng/µL), purity (1.4) and best performance (bg: 100% amplification; gdh: 60% amplification) compared to the other methods evaluated. In the case of trophozoites, the method without pre treatment showed the highest level of DNA concentration, purity, and yield (26.56 ng/µL; 1.85; 100% amplification of bg and gdh, respectively). Conclusions . Mechanical, thermal shock, and enzymatic pre-treatments are necessary for the rupture of the cystic wall of Giardia spp. making it the highest-yielding bg molecular marker for detecting cyst DNA. Trophozoites do not require pre-treatment to achieve satisfactory results. A reproducible methodology for the extraction of DNA from Giardia spp. from any evolutionary stage is available.